外泌体分离
2023-04-04 13:48:39
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超速离心方法可以从细胞培养上清液、血清、血浆、尿液、脑脊液以及其他体液(腹水、羊水、乳液以及唾液等)中的提取外泌体,获取的高纯度外泌体颗粒,可进行后续的NTA、TEM、WB等分析。
样本准备
样本类型 | 样本要求 | 送样量 |
血浆样品 (不能用肝素抗凝) | (1) 用采血针和EDTA抗凝管抽取全血,轻柔上下颠倒混匀后室温或者4°C保存,并在1小时内进行下一步处理; (2) 4°C条件下,3000× g离心15min,小心吸取上清,注意避免吸入底部和侧面的沉淀物; (3) 将血浆冻存于-80°C; 提示:送样量最好4 ml以上(分离4 ml血浆约需要8-10 ml全血)。 | >2ml |
血清样品 (有条件的话尽量采用血浆,避免血小板来源的外泌体影响) | (1) 用采血针和普通采血管(不含抗凝剂,10ml规格)采血10 ml; (2) 室温静置 30 min,然后4°C条件下,静置3-4小时(此时可见血块析出); (3) 用移液器吸取上面的淡黄色血清(应该有4 ml左右)转入15 ml离心管中,4°C条件下 3000g离心15min,小心取上清转入新的离心管中; (4) 将血清样品置于-80°C保存; 提示:送样量最好4 ml以上(分离4 ml血清约需要10-15ml全血)。 | >2ml |
细胞上清 (需采用去除外泌体的培养基) | 细胞培养基必须使用去除 exosome的血清或者无血清培养基,以降低背景值的干扰(牛血清中含有大量牛源外泌体)。 (1) 细胞在正常含有血清的培养基中培养一定时间,贴壁细胞密度在70 %-80 %,悬浮细胞密度在60 %-70 %; (2) 对于贴壁细胞,去除原有培养基,换为新的不含外泌体的培养基或者无血清培养基;对于悬浮细胞,300 g,4°C,10 min收集细胞; (3) 使用不含外泌体的培养基或者无血清培养基悬浮细胞并继续培养。细胞继续培养24-48 小时,根据细胞的生长速度确定收取上清时间; (4) 收集细胞上清,300 g,4°C,离心10 min;小心吸取上清,注意避免吸入细胞或者细胞碎片; (5) 3000 g,4°C,再次离心15 min,确保将细胞或者细胞碎片去除干净; (6) 上清0.22µm过滤,去除细胞碎片、凋亡小体和微囊泡; (7) 上清可在4°C短期保存(1-2天),长期保存可冻存于-80°C 。建议细胞上清分离后尽快进行外泌体分离,保存在4°C和-80°C,都会对产量有一定的影响。 | >20ml |
尿液 | (1) 无菌容器采集前/中后段晨尿100ml,并注意避免细菌污染,收集前注意对饮食的控制,于4℃临时保存(不得超过8 h); 加入蛋白酶抑制剂混合物(1.67 ml of100mM NaN3, 2.5ml PMSF (2 mg/ml in isopropyl alcohol), 50 µl Leupeptin (1 mg/ml in ddH2O)); (2) 并于3000×g离心15min,去除细胞或细胞碎片; (3) -80℃冰箱中保存。 | >20ml |
脑脊液 | (1) 收集脑脊液10ml,采集方式为腰椎穿刺,样本一经分离,请务必立即置于冰上或4℃短暂保存(不得超过4 h),避免受到血液污染,勿使用含肝素抗凝剂的采样管收集盛放; (2) -80℃冰箱中保存。 | 10ml |
胸水 | (1) 临床收集胸水后若不能第一时间处理,请于4℃临时保存(不得超过8 h); (2) 将收集到的胸水1000 g离心10 min,收集上清液; (3) 将得到的胸水上清3000 g离心10 min,收集上清; (4) -80℃冰箱中保存。 | 30ml |
腹水 | (1) 临床收集腹水后若不能第一时间处理,请于4℃临时保存(不得超过8 h); (2) 将采集到的腹水在4℃下(室温亦可)离心2000 g,20 min,去除腹水中的残渣; (3) -80℃冰箱中保存。 | 30ml |
胆汁 | (1) 用无菌容器收集胆汁; (2) 将收集到的胆汁在4℃下,3000 g离心10 min去除细胞沉渣和碎片; (3) 收集胆汁上清液,4℃或者-20℃长期保存。 | 5ml |
检测周期:
实验室收到样本后10-15个工作日内完成检测,提供外泌体抽提步骤和报告。